|
|
Vliv makroelementů z potravy na DNA a epigenetický profil
Veselý, Zdeněk ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Makroelementy obsažené v potravě mají důležitou funkci pro lidský organismus. Podílí se na řadě biochemických reakcí v lidském těle a jejich vyvážené množství je důležité pro prevenci vážných onemocnění. V teoretické části bakalářské práce byla popsána funkce minerálních látek v lidském organismu, funkce DNA a epigenetických mechanismů, jako je metylace DNA nebo modifikace histonů. Byl popsán vliv výživy a funkce vybraných makroelementů – sodík, hořčík, vápník, draslík na epigenetické modifikace a na stabilitu G-kvadruplexů. Cílem experimentální části práce bylo studovat vliv těchto látek na DNA struktury in vitro a připravit experimentálně pro studium in vivo.
|
|
|
Polyphenols in nutritions and their effect on DNA
Osorio, Juan ; Černayová, Diana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Epidemiological studies have shown the effect of plant-derived food consumption in the prevention of a wide range of diseases. The natural antioxidants present in these foods, among which polyphenols are very relevant, may be responsible for this health-promoting activity. The aim of this bachelor thesis is to submit evidence in the interaction of certain polyphenols with the genetic material through different signaling mechanisms, especially regarding the stabilization of the non-canonical DNA structure G-quadruplex and therefore point out the most selective substance to inhibit biochemical processes. Furthermore, the thesis includes detailed information that might help understand how polyphenol compounds can be attached to the DNA through epigenetic mechanisms and G4 structures, and which factors may affect the efficiency of these. Different experiments, by biological and experimental repetition, were used to corroborate the interaction between the compounds and DNA.
|
|
|
Bioinformatické analýzy lokálních struktur DNA u vybraných patogenů
Dobrovolná, Michaela ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Onemocnění způsobená parazitickými červy jsou velmi rozšířená u lidí v rozvojových zemích. Podle WHO jsou parazity celosvětově infikovány přibližně 2 miliardy lidí. Etiologickými činiteli parazitických infekcí jsou zejména parazité kmene Nematoda (hlístice) a Platyhelminthes (ploštěnci) vyvolávající reakce imunitního systému, způsobující podvýživu a chudokrevnost, které jsou primární příčinou úmrtí. Vzrůstající rezistence parazitů na lidská anthelmintika je urychlována jejich nadužíváním, špatnou prevencí a kontrolou infekce. Terapeutický potenciál malých molekulových G4 ligandů byl demonstrován například při stabilizaci struktur G-kvadruplexů, anebo eliminaci patogenů rezistentních na léky. G-kvadruplexy jsou typem sekundární struktury nukleových kyselin tvořené v oblastech bohatých na guanin se schopností regulovat proces genové exprese, opravy poškozené DNA nebo transkripce a translace v onkogenech. K identifikaci a porovnání sekvencí potenciálně tvořících G-kvadruplex (PQS) v jaderných a mitochondriálních genomech šesti zástupců kmene Platyhelminthes a čtyř zástupců kmene Nematoda (které by mohly ukázat vhodná cílová místa pro navázání G4 ligandů sloužící k predikci nových míst účinků léčiv a pomoci při vývoji efektivnějších léčiv) byl požit webový nástroj G4Hunter. Byla potvrzena nenáhodná distribuce PQS v genomu a mtDNA analyzovaných organismů. Nejvíce G-kvadruplexů bylo lokalizováno v těsné blízkosti genů, což naznačuje jejich roli v genové regulaci. Zajímavé je, že v méně infekčních zástupcích kmene Platyhelminthes bylo nalezeno více PQS v porovnání s více infekčními zástupci téhož kmene. Naproti tomu byla u organismu Ascaris lumbricoides spadajícího do kmene Nematoda dokázána přítomnost vysoce stabilních PQS. Tento vysoce patogenní druh je schopen tolerovat velmi stabilní G4, které nejsou u srovnávacího organismu Caenorhabditis elegans téměř vůbec přítomny.
|
|
|
Vliv přírodních a syntetických ligandů G4 na transaktivaci p53
Perná, Kristýna ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
V promotorech lidských genů se vyskytují sekundární struktury DNA, jako jsou například G-kvadruplexy. Dysfunkce těchto kvadruplexových struktur byly pozorovány u několika případů nádorových onemocnění, a proto jsou tyto struktury předmětem výzkumu pro návrh nových protinádorových léčiv. Protein p53 je důležitým regulačním proteinem v procesu řízení buněčného cyklu a opravy DNA. Mutace v genu kódující tento protein se objevují u více než 50 % případů onkologických onemocnění. V této práci byl zkoumán vliv přírodních ligandů, vázající se na G-kvadruplexy, na vazbu a aktivitu proteinu p53. V teoretické části diplomové práce byla popsána struktura a vazebné vlastnosti proteinu p53, struktura a role G-kvadruplexů a byly popsány vybrané G4-ligandy vyskytující se v potravinách – kurkumin, kvercetin, berberin a kyselina ellagová. Cílem experimentální části této práce bylo zjistit vliv těchto látek na transaktivační aktivitu proteinu p53 in vivo na základě jejich interakce s G-kvadruplexy pomocí kvasinkových izogenních systémů. Interakce mezi vybranými G-kvadruplexovými strukturami a ligandy byla nejprve ověřena in vitro pomocí ThT testu a cirkulárního dichroismu.
|
|
|
Využití kvasinkového isogenního systému pro studium interakcí proteinu IFI16 s DNA
Kratochvilová, Libuše ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovaného proteinu 16 (IFI16) k sekundárním lokálním strukturám G-kvadruplexu (G4) a jeho mutacím v jednohybridním kvasinkovém systému (Y1H). Protein IFI16 v buňce rozpoznává vlastní a cizorodou nebo poškozenou DNA, podílí se na tvorbě inflamazomu a indukuje expresi interferonu typu I (IFN-I). Rovněž má podíl na regulaci transkripce a restrikci virové infekce. Bylo prokázáno, že protein IFI16 se preferenčně váže ke strukturám G-kvadruplexů a je schopen je touto vazbou stabilizovat. G-kvadruplexy jsou řazeny mezi nekanonické struktury DNA a RNA tvořené sekvencemi bohaté na G. Snadno jsou tvořeny za fyziologických podmínek a nachází se v řadě významných regulačních strukturách genomu jako jsou telomery nebo promotory onkogenů. Jsou také součástí řady virových genomů. To z nich dělá vynikající potenciální cíle při léčbě nádorových a virových onemocnění. V první experimentální části práce byly připraveny nové reportérové kmeny kvasinek S. cerevisiae metodou Delitto Perfetto, které se lišily pouze v sekvenci s potenciálem tvorby G-kvadruplexu, které byly navrženy a analyzovány programem DNA Analyser. Správnost vkládaných sekvencí byla ověřena PCR a Sangerovým sekvenováním a srovnáním s dodanými sekvencemi oligonukleotidů programem Blast. V druhé části práce byly nově připravené kmeny transformovány vektory pro expresi proteinů p53, IFI16 a posuzován vliv vazby IFI16-G4 na expresi reportérového genu ve spojitosti s nádorovým supresorem p53 s využitím luciferázových reportérových testů. Vyhodnocení proběhlo na základě statistické analýzy velikostí účinků získaných po normalizování signálu luminescence na optickou hustotu kultury při vlnové délce 600 nm. Ze získaných výsledků vyplývá, že protein IFI16 má různý vliv na trans-aktivační potenciál nádorového supresoru p53 v závislosti na vazbě k vznikajícím strukturám v blízkosti promotoru genu, a že k úspěšnému vytvoření G-kvadruplexu bylo třeba dosáhnout prahové hodnoty G4Hunteru skóre alespoň 1,591 a zohlednit potenciál dané sekvence formovat úspěšně alespoň 2 G-tetrády.
|
|
|
Sekvence tvořící G-kvadruplexy v lidském genu a jeho homolozích pro amyloid beta prekursor
Stránská, Anna ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
APP gen kóduje transmembránový protein amyloid beta prekursor, který je exprimován v mnoha typech buněk, včetně neuronů. Jeho funkce nebyly zatím zcela popsány, je ale zřejmé, že u něj probíhá štěpení před exportem do extracelulárního prostoru. Dochází k jeho degradaci po různých rozkladných drahách a homodimerizaci, při které mohou vzniknout částice s protektivní funkcí neuronů stejně tak jako fragmenty, které jsou toxické a způsobují smrt nervových buněk. Vznik škodlivých amyloidních beta plaků a jejich hromadění mezi neurony v mozku je úzce spjato se vznikem a postupem Alzheimerovy choroby, neurodegenerativního onemocnění mozku projevujícího se smrtí a ztrátou neuronů, která vede k nástupu demence, tedy ztráty kognitivních funkcí. V současné době existuje mnoho výzkumů, které se zabývají souvislostmi mezi neurodegenerativními onemocněními a výskytem G-kvadruplexů v genech, které jsou zapojeny do projevů nemocí. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární struktury nukleových kyselin DNA a RNA, které vznikají v oblastech bohatých na guanin. Jsou významné především z hlediska jejich spojitosti s biologickými procesy jako je regulace genové exprese v genech a převážně v onkogenech, protože se vyskytují ve významných oblastech genu jako je promotor. Je možné je stabilizovat malými molekulami, a právě této schopnosti je využíváno ve výzkumu terapeutické léčby různých onemocnění. Ke zjištění důležitosti vyplývající z lokalizace a konzervovanosti G-kvadruplexů vyskytujících se v lidském APP genu, byla provedena bioinformatická analýza jak genu člověka, tak 346 dalších genových homologů. Pro tento účel byl použit program G4Hunter, který poskytl informace o nalezených sekvencích s potenciálem tvořit G-kvadruplex, jako je jejich umístění či G4Hunter skóre. Dále byla provedena in vitro analýza pomocí činidla thioflavin T, která otestovala schopnost nalezených sekvencí tvořit G-kvadruplexy za fyziologických podmínek. Výsledky potvrdily přítomnost a evoluční důležitost G-kvadruplexů nalezených v APP genu Homo sapiens a jejich schopnost skládat se v přítomnosti solí jako je sodík a draslík do kvadruplexních struktur.
|
|
|
Optimalizace algoritmu pro detekci G-kvadruplexů
Labudová, Dominika ; Martínek, Tomáš (oponent) ; Hon, Jiří (vedoucí práce)
Detekcia G-kvadruplexov v DNA bola v posledných rokoch cieľom viacerých štúdií. Dôsledkom bol vznik viacerých identifikačných nástrojov. Táto bakalárska práca sa zameriava na analýzu a optimalizáciu nástroja pqsfinder ako aj vytvorenie užívateľského rozhrania pre tento nástroj. Optimalizácia poskytla významný nárast v rýchlosti algoritmu a taktiež jeho schopnosti spracovávať dlhé DNA sekvencie. Užívateľské rozhranie bolo navrhnuté a implementované za použitia moderných a efektívnych technológií s dôrazom na užívateľskú prívetivosť webovej aplikácie.
|
|
|
Přítomnost a lokalizace lokálních DNA struktur v genomech papilomavirů
Vyoralová, Andrea ; Kollerová, Silvia (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Papilomaviry jsou pohlavně přenášené patogeny o délce genomu asi 8 kbp. Pravděpodobnost, že se dospělý člověk setká s nákazou papilomaviry je až 80–90 %. Ve většině případů se s infekcí vypořádá imunitní systém. U žen může však infekce vést až k rozvoji rakoviny děložního čípku. Tu způsobují vysoce rizikové lidské papilomaviry, proti nimž je dostupná vakcinace. V genomech papilomavirů byly nalezeny sekvence bohaté na guanin, ve kterých dochází k tvorbě G-kvadruplexů. Ty jsou tvořeny nad sebe naskládanými G-tetrádami a jsou stabilizovány monovalentními kationty, nejčastěji K+ a Na+. Nacházejí se například v telomerách, promotorech onkogenů, vazebných místech transkripčních faktorů a rekombinačních místech. V genomech těchto virů se rovněž nacházejí inverzní repetice (IR) složené ze sekvence nukleotidů, po níž následuje její reverzní komplement. Inverzní repetice se označují jako hotspoty genomové nestability, jelikož se skládají do vlásenkových nebo křížových struktur, které narušují replikaci DNA. K analýze genomů byl použit G4Hunter a Palindrome analyser. Analýzou bylo zjištěno, že výskyt potenciálních sekvencí tvořících G-kvadruplex (PQS) je vyšší v papilomavirech infikujících obratlovce než ve virech infikujících člověka, což je způsobeno vyšším obsahem guaninu a cytosinu, které bývají s tvorbou PQS spojovány. V genomech papilomavirů byla zjištěna vyšší frekvence výskytu PQS než u Archaea, Bacteria a Homo sapiens. Analýza IR prokázala, že je v genomech nejvyšší zastoupení nejkratších IR (6 bází) a také to, že IR o délce 25–30 bází se nachází pouze v několika málo genomech.
|
|
|
Study on the relation between G-quadruplexes and p53-driven regulation
Holotová, Paulína ; Vodička, Juraj (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
This thesis deals with the role of G-quadruplex structures, their stabilisation using ligands and the role of p53 in transcription regulation. G-quadruplex is a type of nucleic acid secondary structure composed of 2 – 4 tetrads. Each tetrad is formed by four guanines linked by Hoogsten base pairing. This work consisted of theoretical and experimental parts. The theoretical part described the nature of G-quadruplex structures and their potential for cancer treatment, the role of p53 in the cell cycle and its regulation, and the ligands curcumin and TMPyP4 used for G4 stabilization. In the experimental part, the interactions of the curcumin and TMPyP4 with nucleic acid structures were studied. Reporter yeast strains containing PUMA, KSHV, and their combinations were transformed with plasmids encoding only selection markers and plasmids encoding the wild type form of the gene for protein p53. In the viability assay, the optimal ligand (curcumin and TMPyP4) concentration was determined for reporter yeast strain PUMA, which was further used in Luciferase assay. A fluorescence indicator displacement assay with Thioflavin T as a fluorescence dye proved the interaction between G4-forming oligonucleotides, and curcumin and TMPyP4. Luciferase assay was used to evaluate the interaction between transformed reporter yeast strains and both ligands. The results after 24 hours showed statistical significance for each strain in the same environment, where the PUMA strain showed the highest transactivation activity: the PUMA insert is a target gene for p53. Sequences with both PUMA and KSHV showed significantly lower transactivation activity, as ligands may have stabilized the G4-structure present in KSHV and thus down- regulate transcription. The presence of G4 in the KSHV sequence was also confirmed using the G4Hunter, with a G4Score of 3.182. Transactivation was significantly lower in the PUMA strains present in curcumin and TMPyP4 environment, although this sequence was not predicted to form G4, which was also confirmed in the G4Hunter analysis. This suggests that studied ligands curcumin and TMPyP4 may regulate the cell metabolism in a different than previously predicted way.
|
|
|
Analýza vazby proteinu IFI16 na DNA
Kratochvilová, Libuše ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovatelného proteinu 16 (IFI16) na DNA s potenciálem tvorby G-kvadruplexu. Protein IFI16 obsahuje dvě tandemově umístěné DNA-vazebné HIN domény vykazující rozdílnou vazbu ke strukturám DNA. Bylo prokázáno, že protein IFI16 preferenčně váže struktury G-kvadruplexů oproti jiným strukturám DNA. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární lokální struktury DNA (nebo RNA), které se snadno formují za fyziologických podmínek v řadě významných regulačních oblastech genomu, nebo jsou součástí genomů řady virů a patogenů. Schopnost rozpoznání, specifické vazby a stabilizace struktur G-kvadruplexů odráží zapojení proteinu IFI16 do buněčných procesů replikace, transkripce a translace a iniciaci vrozených imunitních odpovědí. V první části diplomové práce byly vybranými biofyzikálními metodami charakterizovány sekvence syntetických oligonukleotidů s potenciálem tvorby G-kvadruplexu a izolován protein IFI16 plné délky, který byl následně použit pro in vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty s charakterizovanými oligonukleotidy. V poslední části práce byly kvasinkové isogenní kmeny lišící se sekvencemi responzivního elementu transformovány plazmidovými vektory pro expresi proteinů p53 a IFI16 s konstitutivními i GAL inducibilními promotory a optimalizován model jednohybridního kvasinkového systému pro studium interakcí proteinu IFI16 in vivo. Z výsledků vyplývá, že většina analyzovaných sekvencí je schopna in vitro tvořit struktury G-kvadruplexu, a to i za přítomnosti pouze jednoho opakování tří a více G-bází. Zatímco přítomnost několika opakování guaninových bází oddělených jednonukleotidovým spacerem vedla k tvorbě intermolekulárních struktur G-kvadruplexů, mutace v původní sekvenci G-kvadruplexu indukovala tvorbu intramolekulárních struktur s rozdílnými konformacemi. In vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty prokázaly specifickou vazbu proteinu IFI16 ke strukturám G-kvadruplexů bez rozdílů preference vazby proteinu k určité konformaci G-kvadruplexu. Stabilizace struktur G-kvadruplexu in vivo za responzivním elementem transkripčního faktoru (p53) v promotoru reportérového genu indukovala represi transkripce daného genu. Při absenci jakéhokoliv vazebného místa proteinu IFI16 docházelo k protein-proteinové interakci mezi proteiny IFI16 a p53, která vedla ke zvýšení transaktivačního potenciálu proteinu p53, přičemž vazba proteinu p53 a iniciace transkripce reportérového genu byla ovlivněna nejen přítomností motivu G-kvadruplexu a jeho stabilizací, nýbrž i sekvencí DNA sousedící s responzivním elementem p53.
|
host ::
RSS.